А.Е. Болдова1,2, Д.Ю. Нечипуренко1,2,3, М.А. Пантелеев 1,2,3, А.Н. Свешникова1,2,3а
1. Центp теоpетичеcкиx пpоблем физико-xимичеcкой фаpмакологии PАН,Россия, 109029, г. Моcква, ул. Средняя Калитниковская, д. 30
2. Национальный медицинcкий иccледовательcкий центp детcкой гематологии, онкологии и иммунологииим. Д. Pогачева,Россия, 117997, г. Моcква, ул. Cамоpы Машела, д. 1
3. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Россия, 119991, г. Моcква, Ленинcкие Гоpы, д. 1, корп. 2
E-mail: a a.sveshnikova@physics.msu.ru
Determining the Role of Cytoskeletal Reorganization in Clustering of Platelet Receptors (GPVI) to Collagen Using Agent-Based Modeling
A. E. Boldova1,2 D. Yu. Nechipurenko1,2,3, M.A. Panteleev 1,2,3, A. N. Sveshnikova1,2,3а
1. Center for Theoretical Problems of Physico-chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 30 Srednyaya Kalitnikovskaya st., Moscow, 109029, Russia
2. Dmitry Rogachev National Medical Research Centre of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, 1 Samory Mashela st., Moscow, 117997, Russia
3. Lomonosov Moscow State University, 1/2 Leninskiye Gory, Moscow, 119991, Russia
E-mail: a a.sveshnikova@physics.msu.ru
Получено: 28.08.2024 Принято к публикации: 24.09.2024 Опубликовано: 30.12.2024
EDN: KJFYAJ
Аннотация
Передача внешнего стимула внутрь клетки обычно осуществляется за счет работы клеточных рецепторов. Можно выделить целый класс рецепторов, для которых одним из важнейших этапов передачи сигнала является кластеризация. В качестве основных индукторов кластеризации чаще всего рассматривают либо их связывание с общим лигандом, либо изменение аффинности друг к другу. Регуляция процесса кластеризации мембранных рецепторов происходит за счет целого ряда факторов, зависящих как от молекулы активатора (например, его структура и валентность), так и от микроокружения рецепторов в мембране клетки (вязкость и текучесть локального участка мембраны, определяемая липидным составом). Однако, недавно стало известно, что возможно существование еще одного фактора микроокружения, влияющего на процесс кластеризации, а именно: локальной перестройки цитоскелета клетки при активации рецепторов. Данный процесс приводит к увеличению подвижности молекул в ограниченной области, в результате чего возможно значительное повышение вероятности столкновения с другими рецепторами и их последующей активации.
В настоящей работе была разработана компьютерная модель активации тромбоцитарных рецепторов GPVI от коллаген подобного пептида, учитывающая липидное микроокружение и способность активированного рецептора инициировать перестройку цитоскелета.
С помощью данной модели была проведена оценка роли локальной перестройки цитоскелета в покое и при активации. Было показано, что количество кластеризованных рецепторов как в состоянии покоя, так и при активации максимально в том случае, когда изменения цитоскелета (и скорости диффузии, соответственно) носят локальный характер. При постоянных значениях скорости диффузии (как минимально, так и максимально возможных), кластеризация наблюдается для меньшего числа рецепторов.
Таким образом, в данной работе было показано, что локальная перестройка цитоскелета играет одну из важных ролей в процессе кластеризации и активации целого класса мембранных рецепторов.
Ключевые слова: агентное моделирование, кластеризация, рецепторы, кортикальный цитоскелет.
Работа поддержана грантом РНФ 23-44-00082.
Annotation
The process of transmitting external stimuli into the cell is typically achieved through the activity of cellular receptors. A significant number of receptors are capable of clustering, which represents a crucial step in the transmission of signals. The clustering of receptors could be triggered by the binding of a common ligand or a change in receptor affinity. The regulation of membrane receptor clustering depends on multiple factors related both to the activating molecule (such as its structure and valency) and the local membrane environment around the receptors (e.g., the viscosity and fluidity of the membrane area, determined by its lipid composition). It has recently been demonstrated that an additional environmental factor may exert an influence on clustering, namely the local reorganization of the cell's cytoskeleton upon receptor activation. This process increases the mobility of molecules within a restricted area, thereby significantly raising the likelihood of receptor collisions and subsequent activation.
In this study, a computational model was developed to investigate the activation of platelet GPVI receptors by a collagen-like peptide, taking into account the lipid microenvironment and the ability of the receptor to induce cytoskeletal reorganisation upon activation. The model was employed to evaluate the role of local cytoskeletal reorganization in both resting and activated states.
The findings indicated that the greatest number of clustered receptors, both in resting and activated states, was observed when cytoskeletal alterations (and, consequently, diffusion rates) were localised. When the diffusion rates were maintained at a constant level, irrespective of whether they were at their minimum or maximum values, the clustering of receptors was observed to occur for a smaller number of receptors.
The findings of this study illustrate that local cytoskeletal reorganization plays an important role in the clustering and activation of platelet GPVI receptors.
Keywords: agent-based modeling, clustering, receptors, cortical cytoskeleton
The work was supported by the RSF 23-44-00082.
Введение
Одной из часто встречающихся задач математической биологии является моделирование агрегации (кластеризации, полимеризации) белков и других биомолекул [1]. Классическим подходом для решения такой задачи является система уравнений Смолуховского, основанная на законе действующих масс. Данная система позволяет описать временную динамику концентрации агрегатов различного размера [2]. Формирование агрегатов определяется двумя основными процессами: слипанием агрегатов меньшего размера, а также распадом до более мелких агрегатов [2]. В общем виде данный процесс может быть описан в виде следующей реакции: A_i+ A_j↔ A_(i+j) при i, j ≥ 1, где символами Ai, Aj, Ai+j обозначена концентрация агрегатов размера i, j и i+j соответственно [1]. Данной системе реакций соответствует следующая система обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ),где kij – константа скорости «слипания» агрегатов размеров i и j, ki+j – константа скорости разделения большого агрегата на два размерами i и j.
Ограничением такого моделирования, помимо длительности расчетов, является отсутствие достоверное информации о распределении агрегатов по размеру в реальной биологической системе, из-за чего невозможно однозначного определить параметры модели по экспериментальным данным. Для решения первой проблемы ранее была предложена упрощенная схема Смолуховского, при которой сложная мультипараметрическая система уравнений сводится к системе, состоящей из двух ОДУ. Переменными в данном случае будут выступать концентрации отдельных частиц и кластеров, содержащих больше одной частицы. В основе данного подхода лежит предположение о различиях в скоростях ассоциации/диссоциации агрегатов между собой и между агрегатом и отдельной частицей [1]. Данная схема действительно позволяет существенно сократить времена вычислений и количество варьируемых параметров, однако в то же время она дает возможность получить только общую информацию о системе (например, средний размер агрегата и количество одиночных частиц) [1].
Однако для моделирования начальных этапов кластеризации рецепторов описанный выше метод неприменим. В клеточной биологии процессы олигомеризации рецепторов являются ключевыми для множества задач [3]. Особое значение имеет кластеризация рецепторов, ассоциированных с тирозинкиназами – ферментами, которые катализируют фосфорилирование, то есть присоединение фосфатной группы к аминокислотным остаткам тирозина в белках-мишенях [4]. За счет данной модификации значительным образом могут измениться функциональные особенности белков. Она играет огромное значение поскольку управляет активацией, например, иммунных клеток – лимфоцитов [5,6] и нейтрофилов [7,8]. В тромбоцитах – клетках, отвечающих за мониторинг целостности сосудистого русла – одним из таких рецепторов является гликопротеин VI (GPVI) [9,10]. Данный рецептор принадлежит к классу трансмембранных белков, пронизывающих клеточную мембрану. Внеклеточная часть рецептора содержит довольно крупные участки – домены, благодаря которым рецептор может определять наличие активатора во внешнем пространстве. В процессе кластеризации запускается каскад реакций фосфорилирования и образования большого белкового комплекса, называемого сигналосомой. В результате тромбоцит может перейти в активированное состояние: происходит изменение формы, секреция гранул, изменение активности поверхностных белков [10,11].
Одним из основных лигандов GPVI является коллаген [12]. Связывание рецептора с коллагеном обусловлено наличием в последнем повторяющейся аминокислотной последовательности глицин-пролин-гидроксипролин (GPO) [13]. Интересно, что аффинность мономеров и димеров GPVI к коллагену может различаться более чем в 100 раз [12,14,15]. В процессе активации количество димеров GPVI возрастает [14], в результате чего тромбоцит способен связывать больше молекул коллагена. За счет данного механизма возможна реализация положительной обратной связи [12]. Помимо коллагена существует ряд других лигандов GPVI - как естественного происхождения (фибрин [16–19], ламинин [20], адипонектин [21], конвульксин [22,23]), так и синтетических (например, коллаген-подобный пептид – CRP [13,24]), - которые индуцируют кластеризацию и активацию GPVI.
Существенным фактором, влияющим на кластеризацию белков в распределенных системах, является скорость их диффузии [3,25]. Для трансмембранных рецепторов данный параметр определяется свойствами локального микроокружения [26]. Многие рецепторы, ассоциированные с тирозинкиназами (например, рецептор семейства лектиноподбных типа С - CLEC-2, рецептор B-клеток - BCR, рецептор T-клеток - TCR) располагаются в так называемых липидных рафтах. Липидные рафты представляют собой ограниченные области мембраны, обогащенные липидами определённого состава, такими как холестерин и насыщенные глицерофосфолипиды [27–32]. Благодаря присутствию в составе рафта холестерола средняя площадь, приходящаяся на отдельную молекулу липида, уменьшается [33,34]. Таким образом, обеспечивается более высокая плотность упаковки молекул липидов в пределах одного рафта [33,34]. Соответственно, при попадании в липидный рафт способность белков к диффузии может значительно снижаться, что способствует стабилизации образованных белковых кластеров. Рецепторы GPVI также принадлежат классу рецепторов, ассоциированных с тирозин-киназами, и располаются преимущественно в области липидных рафтов [27,35–37].
Еще одним фактором, влияющим на диффузию белков в мембране, является примембранный цитоскелет (кортекс) - сеть актиновых филаментов, формирующая структурный каркас под плазматической мембраной [38]. Толщина кортикального цитоскелета составляет от 50 нм до 400 нм [39,40], а размер ячеек, образуемых актиновыми нитями, составляет 20-200 нм [40]. Филаменты служат «барьерами», препятствующими движению трансмембранных белков [41,42]. При активации клетки запускаются процессы полимеризации и деполимеризации актина, что приводит к изменению размера ячеек сети [43]. Частным случаем такой реорганизации является локальная перестройка цитоскелета, индуцированная связыванием лиганда с тирозинкиназным рецептором [44–46]. Можно предположить, что активация отдельного рецептора вызывает локальную перестройку цитос-келета, приводяшая к локальному ускорению диффузии, и тем самым способствует кластеризации соседних рецепторов. В результате можно ожидать усиление активации клетки и дальнейшую перестройку цитоскелета. Однако, экспериментальная проверка данной гипотезы является крайне сложной задачей. В настоящей работе мы применяем метод агентного моделирования, которое позволяет воспроизвести диффузию и кластеризацию рецепторов (на примере GPVI) в сочетании с динамической реорганизацией примембранного кортекса в ответ на активацию клетки.
Материалы и методы
В данной работе представлена пространственная компьютерная модель динамики диффузии, кластеризации и фосфорилирования GPVI, созданная с использованием метода агентного моделирования (АМ). АМ представляет собой один из методов имитационного моделирования [47]. В основе АМ лежит предположение о том, что система моделируется как совокупность автономных объектов, называемых агентами [48,49]. Каждому агенту присваивается набор характеристик и правил, определяющих как его внутреннее состояние, так и взаимодействие с другими агентами и окружающей средой [47].
Для моделирования был выбран регион плазматической мембраны тромбоцита размером 0.6*0.6 мкм^2 (что составляет приблизительно 2 % от общей поверхности покоящегося тромбоцита). Моделируемый участок состоял из 2 несмешивающихся частей: липидных рафтов и окружающую их мембрану. В роли агентов были выбраны липидные рафты и отдельные рецепторы GPVI. Липидные рафты были представлены в виде круглых областей, чьи радиусы лежат в диапазоне от 4 до 100 нм [50]. В качестве основных параметров для липидных рафтов задавались координаты центров и радиусы. В случае сближения двух рафтов на расстояние, меньшее суммы их радиусов, происходило их слияние в единый рафт. В данном случае образовавшийся рафт инициализировался как новый объект, координаты центра и радиус которого рассчитывались по формулам (1), (2), где (x0, y0), (x1, y1) и (x2, y2) - координаты центров объединенного и двух исходных рафтов; R, R1 и R2-радиусы объединенного и двух исходных рафтов.
В качестве основных параметров для отдельных рецепторов задавались координаты центров, радиусы и состояние (активированное или неактивированное). В рамках модели было принято допущение, что молекулы GPVI могут находиться исключительно в липидных рафтах. Каждый рецептор моделировался как жесткий (недеформируемый) круглый объект радиусом 25 нм [13] и мог находится в одном из двух состояний: неактивированном (дефосфорилированном) и активированном (фосфорилированном) (рис.1). Если расстояние между двумя рецепторами не превышало удвоенного радиуса, считалось, что они образуют кластер. Кластеризация могла происходить как в результате случайных столкновений рецепторов в мембране, так и за счет механического стягивания, осуществляемого молекулами активатора с фиксированным расстоянием между сайтами связывания. Находясь в кластере, неактивированный GPVI мог перейти в активированное состояние с вероятностью Рact. Данный параметр определялся несколькими факторами: концентрацией активирующих Src-киназ в заданной области [51], а также их константой диссоциации с рецептором [3]. Поскольку Src-киназы располагаются преимущественно в области липидных рафтов [36], в модели предполагалось, что их количество пропорционально площади отдельного рафта. Таким образом, вероятность активации i-го рецептора описывалась следующим уравнением (3), где P0 – вероятность активации кластеризованного рецептора, Ri- радиус липидного рафта, в котором находился i-рецептор, SLo-площадь липидных рафтов. Площадь липидных рафтов составляла 35 % [52,53] от площади мембраны и для моделируемого участка равна 0.126 мкм2. Предполагается, что деактивация рецептора может происходить случайным образом с вероятностью Pdeact.
В начальный момент времени все липидные рафты можно было разделить на 2 категории: свободные липидные рафты, не содержавшие рецепторов, а также связанные рафты, принадлежавшие отдельным рецепторам. Радиусы связанных липидных рафтов равны 25 нм. Количество свободных липидных рафтов вычислялось по следующей формуле (4), где SLo - площадь, занимаемая липидными рафтами, GPVI0 - количество рецепторов GPVI на моделируемом участке мембраны, Rbound - радиус связанного липидного рафта в начальный момент времени, Rmin, Rmax – минимальный и максимальный радиусы свободных липидных рафтов в начальный момент времени соответственно.
В начальный момент времени координаты рецепторов GPVI задавались случайным образом. Связанные липидные рафты позиционировались так, чтобы их центры совпадали с координатами соответствующих рецепторов. Координаты центров остальных липидных рафтов распределяются в свободном пространстве. Радиусы свободных липидных рафтов выбирались также случайно в соответствии с нормальным распределением и лежали в диапазоне от 4 нм до 100 нм. При инициализации модели происходило объединение перекрывающихся липидных рафтов с образованием единого рафта. Центр и радиус образованного рафта вычислялись по формулам (1-2).
В основе модели лежало предположение о том, что движение объектов (отдельных молекул GPVI и липидных рафтов) можно рассматривать как броуновское и, следовательно, описывать с помощью формулы Эйнштейна-Смолуховского. Таким образом, смещение r центра отдельной частицы в двумерном пространстве описывалось следующим уравнением:r=√4D∆t, (5)где D–коэффициент диффузии объекта (рафтов или отдельных рецепторов GPVI), Δt – шаг времени.
Положение элементов модели вычислялось итеративно на основе их координат на предыдущем временном шаге. Координаты центра каждого рецептора GPVI определялись относительно центра липидного рафта, в котором тот был локализован.
Для обеспечения строгой локализации рецепторов в пределах своих мембранных доменов были заданы граничные условия. Если в результате расчёта новое положение молекулы GPVI оказывалось за пределами её рафта (т.е. расстояние от центра рецептора до центра рафта превышало его радиус), то направление её смещения изменялось на противоположное. При этом величина смещения сохранялась, что физически соответствует упругому отражению от границы домена.
В рамках модели предполагалось, что коэффициент диффузии рецепторов определялся относительной плотностью цитоскелета в месте их расположения. Коэффициент диффузии липидного рафта был обратно пропорционален натуральному логарифму его радиуса и также зависел от плотности актинового цитоскелета [41,54].
В построенной модели актиновый цитоскелет был задан неявным образом как фактор μ, влияющий на коэффициент диффузии рецепторов и липидных рафтов. Фактор μ обратно пропорционален относительной плотности цитоскелета в выбранной точке. Предполагалось, что в покоящемся состоянии в области неактивированных одиночных рецепторов μ0=0.001. Также считалось, активация рецептора запускает процесс «таяния» (снижение плотности) цитоскелета, который описывался нормальным распределением. Фактор μ в каждый момент времени представлял собой сумму сигналов от всех активных источников, однако не мог превышать максимальное значение μmax=1. В общем виде данная величина в момент времени t произвольной точке c координатами (x, y) мембраны задавалась следующим уравнением (6), где ν-эффективность «таяния» цитоскелета-определяет максимальный сигнал от отдельного источника, xi, yi, - координаты i-го источника сигнала, δ-скорость распространения сигнала «таяния» цитоскелета, τi-время, прошедшее после активации i-го источника сигнала. Через время τd уровень сигнала, распространяемого от отдельного источника, становился меньше μ0, соответственно, его вкладом можно было пренебречь.
Коэффициенты диффузии GPVI при различных плотностях актинового цитоскелета, распределения размеров липидных рафтов рецепторов были получены из литературы. Неизвестные параметры были подобраны на основе доступных экспериментальных данных [55]. Параметры модели приведены в Таблице 1.
Модель была разработана в языке программирования Python, с использованием стандартных общедоступных библиотек numpy, scipy, pandas.
Статистический анализ проводился посредством программного обеспечения GraphPad Prism v9.5.1 (Калифорния, США).
Результаты
Сопоставление результатов работы модели и существующих экспериментальных данных.
В рамках данной модели предполагалось, что активирующие молекулы не влияют на вероятность активации рецепторов напрямую, но способствуют их кластеризации. Соответственно, ключевыми параметрами активатора, регулирующими результат работы модели, являлись: концентрация, валентность (максимальное число связывающих рецепторов), а также наименьшее расстояние между ближайшими сайтами связывания.
Действие активатора в модели было задано следующим образом: при инициализации часть рецепторов GPVI случайным образом оказывалась жестко связанной внутри единого липидного рафта, причем расстояние между центрами рецепторов соответствовало расстоянию между сайтами связывания активатора. После запуска модели, эти рецепторы могли свободно диффундировать и вращаться с коэффициентом диффузии, обратно пропорциональным размеру кластера.
В качестве активатора GPVI был рассмотрен CRP. Данный пептид способен связывать вместе до 5 рецепторов, причем расстояние между двумя ближайшими сайтами не превышало удвоенного радиуса отдельного рецептора GPVI [13]. Таким образом, благодаря 1 молекуле CRP 5 рецепторов могли быть объединены в единый кластер. В модели принималось, что связывание рецепторов и молекулы CRP являлось необратимым.
Состояния мембраны в различных условиях представлены на рис. 2А, Б. В результате расчетов было показано, что при активации 5 мкг/мл CRP доля кластеризованных рецепторов была статистически значимо (p<0.05) выше, чем в стационарном состоянии (рис. 2Г). Кроме того, была произведена оценка степени «таяния» цитоскелета (представляющая собой интегральное значение коэффициента μ) при различных условиях (рис. 2В). Как можно видеть из гистограмм распределения (рис. 2В), степень «таяния» при активации была значительно выше, чем в покоящемся состоянии клетки.
Оценка влияния цитоскелета.
Для определения роли цитоскелета в поддержании состояния покоя и инициации активации были рассмотрены следующие ситуации: (1) степень «таяния» цитоскелета регулировалась сигналом от активированного рецептора; (2) актиновый цитоскелет не препятствовал движению, что соответствовало максимальному коэффициенту диффузии в каждой точке мембраны (в данном случае степень «таяния» принимала наибольшее значение μmax); (3) динамика актинового цитоскелета не зависела от активации отдельных рецепторов, что соответствовало минимальному значению коэффициента диффузии в каждой точке мембраны (степень «таяния» цитоскелета принимала наименьшее значение, равное μ0). Результаты вычислений представлены на рис.3. Было установлено, что при максимальной степени «таяния» (μ =μmax) доля кластеризованных рецепторов (обозначены синими ромбами) была статистически значимо меньше как в состоянии покоя, так и при активации 5 мкг/мл CRP по сравнению со случаем, когда μ мог изменяться в зависимости от активации и кластеризации (обозначены красными кругами). Для минимальной степени «таяния» (μ= μ0), как и ожидалось, доля кластеризованных рецепторов (обозначены зелеными треугольниками) была также существенно ниже, чем в случае изменяющейся μ.
Обсуждение и заключение
В настоящей работе была впервые разработана агентная компьютерная модель кластеризации рецепторов GPVI тромбоцита, учит¬ывающая динамику цитоскелета в процессе активации. Данная модель позволяет оценить не только распределение кластеров рецепторов GPVI в различные моменты времени после активации, но и исследовать влияние перестроек цитоскелета на процессы активации и олигомеризации. За основу модели была принята одна из гипотез, предложенная для описания кластеризации и активации другого рецептора, запускающего тирозинкиназную сигнализацию, - рецептора В-клеток (BCR) [43,58,59]. Согласно литературным данным в покоящихся В-клетках диффузия BCR ограничена актиновым цитоскелетом, причем скорость диффузии обратно пропорциональна плотности актинового цитосклета, расположенного под мембраной [58,60].
В первую очередь, с помощью построенной модели была оценена доля кластеризованных рецепторов. Особый интерес представляют результаты, полученные для состояния покоя. С помощью модели было показано, что более 30% рецепторов GPVI находятся в кластерах даже при отсутствии активатора. Этот результат согласуется с известным экспериментальным данным для GPVI [55]. Явление кластеризации рецепторов, ассоциированных с тирозинкиназами, при отсутствии активации характерно не только для тромбоцитов. Ярким примером служит BCR. С помощью высоко чувствительных методов было показано, что в состоянии покоя на поверхности В-клеток доля мономеров не превышает 60% от общего количества рецепторов [61]. Добавление активаторов (например, CRP к тромбоцитам или поливалентных фрагментов антител против BCR к В-клеткам) вызывало значительное увеличение доли димеров и олигомеров соответствующих рецепторов на поверхности клеток [55,61]. Эти экспериментальные наблюдения были успешно подтверждены с помощью разработанной модели.
Построенная модель позволяет проверить гипотезу о роли цитоскелета на начальных этапах активации тромбоцита через рецептор GPVI. С помощью модели было показано, что доля кластеризованных рецепторов при постоянной плотности цитоскелета значительно ниже, чем при возможной локальной деполимеризации. Более того, было обнаружено, что при полной деполимеризации цитоскелета (степень «таяния» принимает максимальное значение во всех точках мембраны) доля кластеризованных рецепторов статистически значимо снижается по сравнению с ситуацией, когда степень «таяния» зависит от активации. На первый взгляд, данный результат может показаться неочевидным. При максимальной деполимеризации актинового цитоскелета коэффициент диффузии принимает наибольшее значение, что позволяет отдельным рецепторам двигаться быстрее и чаще сталкиваться. Однако отсутствие ограничений также приводит к увеличению расстояния, на которое рецепторы могут удаляться друг от друга между столкновениями. В случае локального изменения степени «таяния» цитоскелета (и, соответственно, коэффициента диффузии), рецепторы способны двигаться быстро и часто сталкиваться только в небольшой ограниченной области. Это предотвращает их значительное рассеивание. Доказательством нашего вывода могут служить работы [15,62], где экспериментально было показано, что добавление ингибиторов полимеризации актина приводит к снижению количества димеризованных рецепторов.
К настоящему времени опубликован ряд работ, посвященных активации и кластеризации рецепторов GPVI [1,56,63–67]. Большинство из них [1,64–67] основаны на решении системы ОДУ. Такие модели позволяют исследовать общий ответ клетки на действие активаторов и проанализировать отдельные этапы внутриклеточной сигнализации. Однако с их помощью невозможно получить данные о пространственном распределении рецепторов на поверхности мембраны или оценить влияние процессов, имеющих локальный характер. Альтернативным подходом является агентное моделирование. Данный метод был применен в работах [56,63] для исследования димеризации тромбоцитарных рецепторов, ассоциированных с тирозин киназами (а именно, CLEC-2 и GPVI). Авторы исследовали влияние таких параметров, как относительный коэффициент диффузии внутри и вне рафтов, размер рафтов, содержание дополнительных белков в компартментах. В отличие от нашей работы, в указанных исследованиях влияние цитоскелета не рассматривалось. Процесс активации моделировался путем изменения константы ассоциации мономеров, что не позволяет непосредственно оценить, как различные дозы активатора и его валентность влияют на процесс кластеризации. Тем не менее, выводы нашей работы частично согласуются с результатами работы [56], где показано, что доля кластеризованных рецепторов возрастает, если рецепторы способны свободно двигаться только в ограниченной области.
Большинство существующих работ, посвященных моделированию взаимодействия цитоскелета и мембраны, в первую очередь направлены на то, чтобы предсказать изменения физических свойств мембраны в целом. Подобные модели позволяют рассчитать поверхностное натяжение мембраны, создаваемое примембранным кортексом [68], скорость роста фило- и ламеллоподий [69–72]. Отдельно следует отметить работы [73,74], в которых описаны экспериментальные данные о распределении липидов и формировании липидных рафтов при наличии статичного кортекса под мембраной. Однако, в данных работах не рассматриваются движение и кластеризация мембранных белков.
Построенная нами модель обладает рядом ограничений. Во-первых, в данной модели не реализован механизм разделения больших липидных рафтов на малые при достижении ими критического размера. Во-вторых, модель основана на допущении о том, что рецепторы GPVI могут находиться исключительно в липидных рафтах. В-третьих, в данной работе был рассмотрен упрощенный механизм активации рецепторов GPVI, зависящий только от заякоренных в мембране белков, но не учитывающий работу цитозольных ферментов, локализующихся на мембране в процессе активации.
В результате работы нами была разработана агентная компьютерная модель, позволившая определить роль локальной перестройки примембранного цитоскелета в процессе кластеризации и активации целого класса мембранных рецепторов.
Конфликт интересов: Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Финансирование: Данная работа поддержана грантом Российского научного фонда 23-44-00082
Список используемых сокращений
GPVI – гликопротеин 6 (glycoprotein VI)
CRP – коллаген-подобный пептид (collagen-related peptide)
CLEC-2 - рецептор семейства лектиноподбных типа С (C-type lectin-like)
BCR – B-клеточный рецептор (B-cell receptor)
CH – гомологичный кальпонину (calponin homology)
PIPs – полифосфоинозитиды (polyphosphoinositides)
Список литературы (References)
[1]Garzon Dasgupta AK, Martyanov AA, Filkova AA, Panteleev MA, Sveshnikova AN. Development of a Simple Kinetic Mathematical Model of Aggregation of Particles or Clustering of Receptors. Life 2020;10:97. https://doi.org/10.3390/life10060097.
[2]Лешаков О.Э., Логинов В.М. Коагуляция частиц в стохастической среде. Сибирский журнал индустриальной математики 2000:159–71.
[3]Martyanov AA, Balabin FA, Dunster JL, Panteleev MA, Gibbins JM, Sveshnikova AN. Control of Platelet CLEC-2-Mediated Activation by Receptor Clustering and Tyrosine Kinase Signaling. Biophys J 2020;118:2641–55. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2020.04.023.
[4]Lee MJ, Yaffe MB. Protein Regulation in Signal Transduction. Cold Spring Harb Perspect Biol 2016;8:a005918. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a005918.
[5]Ketchum C, Miller H, Song W, Upadhyaya A. Ligand Mobility Regulates B Cell Receptor Clustering and Signaling Activation. Biophysical Journal 2014;106:26–36. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2013.10.043.
[6]Veneziano R, Moyer TJ, Stone MB, Wamhoff E-C, Read BJ, Mukherjee S, et al. Role of nanoscale antigen organization on B-cell activation probed using DNA origami. Nat Nanotechnol 2020;15:716–23. https://doi.org/10.1038/s41565-020-0719-0.
[7]Bouti P, Webbers SDS, Fagerholm SC, Alon R, Moser M, Matlung HL, et al. β2 Integrin Signaling Cascade in Neutrophils: More Than a Single Function. Front Immunol 2020;11:619925. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.619925.
[8]Langereis JD. Neutrophil integrin affinity regulation in adhesion, migration, and bacterial clearance. Cell Adh Migr 2013;7:476–81. https://doi.org/10.4161/cam.27293.
[9]Свешникова АН., Степанян МГ, Пантелеев МА. Функциональные ответы тромбоцитов и внутриклеточная сигнализация: молекулярные связи. Часть 1: ответы n.d. https://doi.org/10.52455/sbpr.01.202101014.
[10]Степанян МГ, Филькова АА, Гарсон Дасгупта АК, Мартьянов АА, Свешникова АН. Активация тромбоцитов через рецептор GPVI: вариабельность ответа. Биол мембраны 2020;37:442–52. https://doi.org/10.31857/S0233475520060079.
[11]Ollivier V, Syvannarath V, Gros A, Butt A, Loyau S, Jandrot-Perrus M, et al. Collagen can selectively trigger a platelet secretory phenotype via glycoprotein VI. PLoS One 2014;9:e104712. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0104712.
[12]Clark JC, Neagoe RAI, Zuidscherwoude M, Kavanagh DM, Slater A, Martin EM, et al. Evidence that GPVI is Expressed as a Mixture of Monomers and Dimers, and that the D2 Domain is not Essential for GPVI Activation. Thromb Haemost 2021;121:1435–47. https://doi.org/10.1055/a-1401-5014.
[13]Feitsma LJ, Brondijk HC, Jarvis GE, Hagemans D, Bihan D, Jerah N, et al. Structural insights into collagen binding by platelet receptor glycoprotein VI. Blood 2022;139:3087–98. https://doi.org/10.1182/blood.2021013614.
[14]Jung SM, Tsuji K, Moroi M. Glycoprotein (GP) VI dimer as a major collagen-binding site of native platelets: direct evidence obtained with dimeric GPVI-specific Fabs. J Thromb Haemost 2009;7:1347–55. https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2009.03496.x.
[15]Poulter NS, Pollitt AY, Owen DM, Gardiner EE, Andrews RK, Shimizu H, et al. Clustering of glycoprotein VI (GPVI) dimers upon adhesion to collagen as a mechanism to regulate GPVI signaling in platelets. J Thromb Haemost 2017;15:549–64. https://doi.org/10.1111/jth.13613.
[16]Alshehri OM, Hughes CE, Montague S, Watson SK, Frampton J, Bender M, et al. Fibrin activates GPVI in human and mouse platelets. Blood 2015;126:1601–8. https://doi.org/10.1182/blood-2015-04-641654.
[17]Mangin PH, Gardiner EE, Ariëns RAS, Jandrot-Perrus M. Glycoprotein VI interplay with fibrin(ogen) in thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2023;21:1703–13. https://doi.org/10.1016/j.jtha.2023.03.022.
[18]Mammadova-Bach E, Ollivier V, Loyau S, Schaff M, Dumont B, Favier R, et al. Platelet glycoprotein VI binds to polymerized fibrin and promotes thrombin generation. Blood 2015;126:683–91. https://doi.org/10.1182/blood-2015-02-629717.
[19]Mangin PH, Onselaer M-B, Receveur N, Le Lay N, Hardy AT, Wilson C, et al. Immobilized fibrinogen activates human platelets through glycoprotein VI. Haematologica 2018;103:898–907. https://doi.org/10.3324/haematol.2017.182972.
[20]Inoue O, Suzuki-Inoue K, McCarty OJT, Moroi M, Ruggeri ZM, Kunicki TJ, et al. Laminin stimulates spreading of platelets through integrin α6β1–dependent activation of GPVI. Blood 2006;107:1405–12. https://doi.org/10.1182/blood-2005-06-2406.
[21]Riba R, Hughes CE, Graham A, Watson SP, Naseem KM. Globular adiponectin induces platelet activation through the collagen receptor GPVI-Fc receptor gamma chain complex. J Thromb Haemost 2008;6:1012–20. https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2008.02982.x.
[22]Jandrot-Perrus M, Lagrue AH, Okuma M, Bon C. Adhesion and activation of human platelets induced by convulxin involve glycoprotein VI and integrin alpha2beta1. J Biol Chem 1997;272:27035–41. https://doi.org/10.1074/jbc.272.43.27035.
[23]Horii K, Brooks MT, Herr AB. Convulxin forms a dimer in solution and can bind eight copies of glycoprotein VI: implications for platelet activation. Biochemistry 2009;48:2907–14. https://doi.org/10.1021/bi801820q.
[24]Sang Y, Huskens D, Wichapong K, de Laat B, Nicolaes GAF, Roest M. A Synthetic Triple Helical Collagen Peptide as a New Agonist for Flow Cytometric Measurement of GPVI-Specific Platelet Activation. Thromb Haemost 2019;119:2005–13. https://doi.org/10.1055/s-0039-1697660.
[25]Lier M van, Verhoef S, Cauwenberghs S, Heemskerk JWM, Akkerman J-WN, Heijnen HFG. Role of membrane cholesterol in platelet calcium signalling in response to VWF and collagen under stasis and flow. Thromb Haemost 2008;99:1068–78. https://doi.org/10.1160/TH07-08-0528.
[26]Goswami D, Gowrishankar K, Bilgrami S, Ghosh S, Raghupathy R, Chadda R, et al. Nanoclusters of GPI-anchored proteins are formed by cortical actin-driven activity. Cell 2008;135:1085–97. https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.11.032.
[27]Izquierdo I, Barrachina MN, Hermida-Nogueira L, Casas V, Eble JA, Carrascal M, et al. Platelet membrane lipid rafts protein composition varies following GPVI and CLEC-2 receptors activation. J Proteomics 2019;195:88–97. https://doi.org/10.1016/j.jprot.2019.01.014.
[28]Мартьянов AA, Канева ВН, Пантелеев МА, Свешникова АН. CLEC-2-индуцированная внутриклеточная сигнализация в тромбоцитах крови. Биомед химия 2018;64:387–96. https://doi.org/10.18097/PBMC20186405387.
[29]Мартьянов АА, Канева ВН, Пантелеев МА, Свешникова АН. Физиологические и патофизиологические аспекты активации тромбоцитов крови через рецептор CLEC-2. Онкогематология 2018;13:83–90. https://doi.org/10.17650/1818-8346-2018-13-3-83-90.
[30]Stone MB, Shelby SA, Núñez MF, Wisser K, Veatch SL. Protein sorting by lipid phase-like domains supports emergent signaling function in B lymphocyte plasma membranes. eLife 2017;6:e19891. https://doi.org/10.7554/eLife.19891.
[31]Gupta N, DeFranco AL. Lipid rafts and B cell signaling. Seminars in Cell & Developmental Biology 2007;18:616–26. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2007.07.009.
[32]Jury EC, Flores-Borja F, Kabouridis PS. Lipid rafts in T cell signalling and disease. Seminars in Cell & Developmental Biology 2007;18:608–15. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2007.08.002.
[33]Falck E, Patra M, Karttunen M, Hyvönen MT, Vattulainen I. Lessons of slicing membranes: interplay of packing, free area, and lateral diffusion in phospholipid/cholesterol bilayers. Biophys J 2004;87:1076–91. https://doi.org/10.1529/biophysj.104.041368.
[34]Боздаганян МЕ, Шайтан КВ. Исследование структуры рафтов биологических мембран методами компьютерного моделирования. Клиническая Практика 2016:66–72.
[35]Quinter PG, Dangelmaier CA, Quinton TM, Kunapuli SP, Daniel JL. Glycoprotein VI agonists have distinct dependences on the lipid raft environment. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2007;5:362–8. https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2007.02309.x.
[36]Locke D, Chen H, Liu Y, Liu C, Kahn ML. Lipid Rafts Orchestrate Signaling by the Platelet Receptor Glycoprotein VI*. Journal of Biological Chemistry 2002;277:18801–9. https://doi.org/10.1074/jbc.M111520200.
[37]Bodin S, Tronchère H, Payrastre B. Lipid rafts are critical membrane domains in blood platelet activation processes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 2003;1610:247–57. https://doi.org/10.1016/S0005-2736(03)00022-1.
[38]Bovellan M, Romeo Y, Biro M, Boden A, Chugh P, Yonis A, et al. Cellular control of cortical actin nucleation. Curr Biol 2014;24:1628–35. https://doi.org/10.1016/j.cub.2014.05.069.
[39]Kelkar M, Bohec P, Charras G. Mechanics of the cellular actin cortex: From signalling to shape change. Current Opinion in Cell Biology 2020;66:69–78. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2020.05.008.
[40]Svitkina TM. Actin Cell Cortex: Structure and Molecular Organization. Trends Cell Biol 2020;30:556–65. https://doi.org/10.1016/j.tcb.2020.03.005.
[41]Treanor B, Depoil D, Gonzalez-Granja A, Barral P, Weber M, Dushek O, et al. The Membrane Skeleton Controls Diffusion Dynamics and Signaling through the B Cell Receptor. Immunity 2010;32:187–99. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2009.12.005.
[42]Jaqaman K, Grinstein S. Regulation from within: the cytoskeleton in transmembrane signaling. Trends Cell Biol 2012;22:515–26. https://doi.org/10.1016/j.tcb.2012.07.006.
[43]Li J, Yin W, Jing Y, Kang D, Yang L, Cheng J, et al. The Coordination Between B Cell Receptor Signaling and the Actin Cytoskeleton During B Cell Activation. Front Immunol 2019;9. https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.03096.
[44]Jaumouillé V, Farkash Y, Jaqaman K, Das R, Lowell CA, Grinstein S. Actin Cytoskeleton Reorganization by Syk Regulates Fcγ Receptor Responsiveness by Increasing Its Lateral Mobility and Clustering. Developmental Cell 2014;29:534–46. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2014.04.031.
[45]Shi W, Ye B, Rame M, Wang Y, Cioca D, Reibel S, et al. The receptor tyrosine kinase EPHB6 regulates catecholamine exocytosis in adrenal gland chromaffin cells. J Biol Chem 2020;295:7653–68. https://doi.org/10.1074/jbc.RA120.013251.
[46]Papakonstanti EA, Stournaras C. Cell responses regulated by early reorganization of actin cytoskeleton. FEBS Letters 2008;582:2120–7. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2008.02.064.
[47]Стеряков АА. Об одном универсальном методе построения моделей для сложных многоагентных систем. Компьютерные Исследования и Моделирование 2013;5:513–23.
[48]Bonabeau E. Agent-based modeling: Methods and techniques for simulating human systems. Proceedings of the National Academy of Sciences 2002;99:7280–7. https://doi.org/10.1073/pnas.082080899.
[49]ElKalaawy N, Wassal A. Methodologies for the modeling and simulation of biochemical networks, illustrated for signal transduction pathways: A primer. Biosystems 2015;129:1–18. https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2015.01.008.
[50]Deventer S van, Arp AB, Spriel AB van. Dynamic Plasma Membrane Organization: A Complex Symphony. Trends in Cell Biology 2021;31:119–29. https://doi.org/10.1016/j.tcb.2020.11.004.
[51]Burkhart JM, Vaudel M, Gambaryan S, Radau S, Walter U, Martens L, et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood 2012;120:e73-82. https://doi.org/10.1182/blood-2012-04-416594.
[52]Prior IA, Muncke C, Parton RG, Hancock JF. Direct visualization of Ras proteins in spatially distinct cell surface microdomains. J Cell Biol 2003;160:165–70. https://doi.org/10.1083/jcb.200209091.
[53]Ceñido JF, Itin B, Stark RE, Huang Y, Oquendo MA, John Mann J, et al. Characterization of lipid rafts in human platelets using nuclear magnetic resonance: A pilot study. Biochem Biophys Rep 2017;10:132–6. https://doi.org/10.1016/j.bbrep.2017.03.005.
[54]Saffman PG, Delbrück M. Brownian motion in biological membranes. Proc Natl Acad Sci U S A 1975;72:3111–3. https://doi.org/10.1073/pnas.72.8.3111.
[55]Jung SM, Moroi M, Soejima K, Nakagaki T, Miura Y, Berndt MC, et al. Constitutive Dimerization of Glycoprotein VI (GPVI) in Resting Platelets Is Essential for Binding to Collagen and Activation in Flowing Blood. J Biol Chem 2012;287:30000–13. https://doi.org/10.1074/jbc.M112.359125.
[56]Tantiwong C, Dunster JL, Cavill R, Tomlinson MG, Wierling C, Heemskerk JWM, et al. An agent-based approach for modelling and simulation of glycoprotein VI receptor diffusion, localisation and dimerisation in platelet lipid rafts. Sci Rep 2023;13:3906. https://doi.org/10.1038/s41598-023-30884-6.
[57]Haining EJ, Matthews AL, Noy PJ, Romanska HM, Harris HJ, Pike J, et al. Tetraspanin Tspan9 regulates platelet collagen receptor GPVI lateral diffusion and activation. Platelets 2017;28:629–42. https://doi.org/10.1080/09537104.2016.1254175.
[58]Treanor B, Depoil D, Bruckbauer A, Batista FD. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. The Journal of Experimental Medicine 2011;208:1055. https://doi.org/10.1084/jem.20101125.
[59]Mattila PK, Batista FD, Treanor B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol 2016;212:267–80. https://doi.org/10.1083/jcb.201504137.
[60]Tolar P. Cytoskeletal control of B cell responses to antigens. Nat Rev Immunol 2017;17:621–34. https://doi.org/10.1038/nri.2017.67.
[61]Gomes de Castro MA, Wildhagen H, Sograte-Idrissi S, Hitzing C, Binder M, Trepel M, et al. Differential organization of tonic and chronic B cell antigen receptors in the plasma membrane. Nature Communications 2019;10:820. https://doi.org/10.1038/s41467-019-08677-1.
[62]Jaqaman K, Kuwata H, Touret N, Collins R, Trimble WS, Danuser G, et al. Cytoskeletal control of CD36 diffusion promotes its receptor and signaling function. Cell 2011;146:593–606. https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.06.049.
[63]Maqsood Z, Clark JC, Martin EM, Cheung YFH, Morán LA, Watson SET, et al. Experimental validation of computerised models of clustering of platelet glycoprotein receptors that signal via tandem SH2 domain proteins. PLoS Comput Biol 2022;18:e1010708. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1010708.
[64]Dunster JL, Mazet F, Fry MJ, Gibbins JM, Tindall MJ. Regulation of Early Steps of GPVI Signal Transduction by Phosphatases: A Systems Biology Approach. PLOS Computational Biology 2015;11:e1004589. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004589.
[65]Dunster JL, Unsworth AJ, Bye AP, Haining EJ, Sowa MA, Di Y, et al. Interspecies differences in protein expression do not impact the spatiotemporal regulation of glycoprotein VI mediated activation. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2020;18:485–96. https://doi.org/10.1111/jth.14673.
[66]Stepanyan MG, Filkova AA, Garzon Dasgupta AK, Martyanov AA, Sveshnikova AN. Platelet Activation through GPVI Receptor: Variability of the Response. Biochem Moscow Suppl Ser A 2021;15:73–81. https://doi.org/10.1134/S1990747820050074.
[67]Martyanov AA, А МА, Stepanyan MG, Г СМ, Sveshnikova AN, Н СА. Theoretical Explanation for the Variability in Platelet Activation through the GPVI Receptor. Biologičeskie membrany 2023;40:112–21. https://doi.org/10.31857/S0233475523020044.
[68]Chugh P, Clark AG, Smith MB, Cassani DAD, Dierkes K, Ragab A, et al. Actin cortex architecture regulates cell surface tension. Nat Cell Biol 2017;19:689–97. https://doi.org/10.1038/ncb3525.
[69]Korobkin J, Proenza Garcia A, Sveshnikova A. A minimal mathematical model of neutrophil pseudopodium formation during chemotaxis. Systems Biology and Physiology Reports 2021;1:6. https://doi.org/10.52455/sbpr.01.202103012.
[70]Korobkin J, Sveshnikova A. A possible approach to computer simulation of the formation of platelet lamellipodia. Systems Biology and Physiology Reports 2022;1:9. https://doi.org/10.52455/sbpr.01.202263012.
[71]Schaus TE, Taylor EW, Borisy GG. Self-organization of actin filament orientation in the dendritic-nucleation/array-treadmilling model. Proceedings of the National Academy of Sciences 2007;104:7086–91. https://doi.org/10.1073/pnas.0701943104.
[72]Pollard TD, Berro J. Mathematical Models and Simulations of Cellular Processes Based on Actin Filaments*. Journal of Biological Chemistry 2009;284:5433–7. https://doi.org/10.1074/jbc.R800043200.
[73]Machta BB, Papanikolaou S, Sethna JP, Veatch SL. Minimal Model of Plasma Membrane Heterogeneity Requires Coupling Cortical Actin to Criticality. Biophysical Journal 2011;100:1668–77. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2011.02.029.
[74]Honigmann A, Sadeghi S, Keller J, Hell SW, Eggeling C, Vink R. A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes. eLife 2014;3:e01671. https://doi.org/10.7554/eLife.01671.