The role of fluorescent dyes in studies of platelet calcium signaling
Галкина С.В.1, Балабин Ф.А.2,3,#
Galkina S.V.1, Balabin F.A.2,3,#
1. Физический факультет, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, ул. Ленинские горы, д. 1, Москва, Россия, 119991
2. ФГБУН центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, ул. Средняя Калитниковская 30, Москва, Россия, 109029
3. ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева, ул. Саморы Машела, 1, Москва, Россия, 117997
# Автор для переписки: fa.balabin@physics.msu.ru
1. Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University, 1/2 Leninskie gory, Moscow, Russia, 119991
2. Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 30, Srednyaya Kalitnikovskaya str., Moscow, Russia, 109029
3. National Medical Research Centre of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, 1 Samory Mashela St, Moscow, Russia, 117198
Получено: 15.12.2021 Принято к публикации: 27.12.2021 Опубликовано: 30.12.2024
EDN: YBWOBL
DOI: 10.65189/2949-0758-2024-3-2-3-11
Аннотация
Исследование кальциевой сигнализации в тромбоцитах — клетках крови, чьей основной функцией является остановка кровотечения и формирование тромба, — представляет собой важное направление фундаментальных исследований в области гемостаза. Однако такое исследование возможно только с применением кальциевых флуорофоров — низкомолекулярных соединений, которые проникают через мембрану тромбоцита благодаря своей гидрофобной -AM-группе, впоследствии гидролизуемой цитозольными эстеразами. В настоящей работе исследуется явление гетерогенной загрузки кальциевых флуорофоров в тромбоциты.
Мы использовали тромбоциты здоровых доноров, загруженные различными флуоресцентными зондами (CalBryte590, DiOC6(3), Fura Red и Fluo-4) и иммобилизованные на подложке из антител к CD31 в плоско-параллельных проточных камерах. Для регистрации флуоресценции применялась микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF).
Было показано, что все имеющиеся флуоресцентные зонды загружаются неоднородно: примерно у 30% тромбоцитов уровень загрузки в 2–6 раз превышает медианное значение по популяции. На примере зонда CalBryte590 мы продемонстрировали, что снижение температуры инкубации, добавление в инкубационную среду Pluronic F-127 или истощение мембранного холестерина статистически значимо снижают гетерогенность распределения зонда в популяции. Также было установлено, что вероятность сильной активации, оцениваемой по интенсивности кальциевых осцилляций, коррелирует с количеством зонда в тромбоците.
Таким образом, тип используемого флуорофора и условия его загрузки в тромбоциты могут существенно влиять на результаты экспериментов по изучению кальциевой сигнализации.
Ключевые слова: Кальциевая сигнализация, Тромбоциты, Микроскопия полного внутреннего отражения
Annotation
The study of calcium signaling in platelets, blood cells whose main function is to stop bleeding and form a blood clot, is an important area of fundamental research in the field of hemostasis. However, such a study is possible only with the use of calcium fluorophores, low molecular weight compounds that penetrate the platelet membrane due to their hydrophobic AM group, which is subsequently hydrolyzed by cytosolic esterases. In this work, the phenomenon of heterogeneous loading of calcium fluorophores into platelets is investigated.
We used platelets from healthy donors loaded with various fluorescent probes (CalBryte590, DiOC6(3), Fura Red, and Fluo-4) and immobilized on a substrate of CD31 antibodies in plane-parallel flow chambers. Total internal reflection microscopy (TIRF) was used to register the fluorescence.It was shown that all available fluorescent probes are loaded heterogeneously: approximately 30% of platelets have a loading level 2-6 times higher than the median value in the population. Using the CalBryte590 probe as an example, we demonstrated that lowering the incubation temperature, adding Pluronic F-127 to the incubation medium, or depletion of membrane cholesterol significantly reduced the heterogeneity of the probe distribution in the population.
It was also found that the probability of strong activation, estimated by the intensity of calcium oscillations, correlates with the number of probes in the platelet.Thus, the type of fluorophore used and the conditions of its loading into platelets can significantly affect the results of experiments on the study of calcium signaling.
Key words: Calcium signaling, Pletelets, Total internal reflection microscopy
Введение
Кровь является жизненно важным элементом организма человека, для поддержания целостности которого необходима специальная система — система гемостаза. Она подразделяется на плазменное и сосудисто-тромбоцитарное звено [1]. Тромбоциты — мелкие безъядерные клетки крови, основная функция которых заключается в остановке кровотечения при повреждении сосуда. Такой результат достигается путём формирования агрегата и предоставления клеточной поверхности для ускорения работы плазменного звена гемостаза [2]. Обнажение внеклеточного матрикса запускает процесс перехода тромбоцитов в так называемое активированное состояние. Они агрегируют друг с другом, адгезируют к поверхности [3], изменяют форму, секретируют содержимое гранул [4] и в ряде случаев приобретают прокоагулянтные свойства [5,6]. В конечном итоге формируется кровяной сгусток [7].
Особенность активации тромбоцитов — её быстрая реакция на повреждение с характерным временем порядка одной секунды [8]. Такая скорость ответа обеспечивается внутриклеточной сигнальной системой тромбоцитов, ключевую роль в которой играют ионы кальция. В покоящихся клетках концентрация свободного кальция в цитозоле поддерживается на низком уровне (примерно 10–20 нМ) [9] по сравнению с плазмой крови (1–2 мМ), в то время как в эндоплазматическом ретикулуме, основном внутриклеточном депо кальция в тромбоцитах, его концентрация составляет около 100–800 мкМ [10]. Активация тромбоцитов, как и многих других клеток, регулируется концентрацией ионов кальция в цитозоле, поскольку они выступают кофакторами для множества ферментов, опосредующих данный процесс [11–13].
Кальциевая сигнализация тромбоцитов давно исследуется как в суспензии клеток [14,15], так и на уровне отдельных тромбоцитов [16–18]. Исследования проводятся с помощью внутриклеточных флуоресцентных зондов — малых органических молекул-флуорофоров, параметры возбуждения и/или флуоресценции которых существенно изменяются при связывании ионов кальция [19]. Для загрузки зондов в живую клетку без повреждения мембраны используется метод пассивной диффузии. Для этого молекулы зонда делают более гидрофобными, модифицируют путем добавления ацетометильного остатка, который гидролизуется внутри клетки неспецифическими эстеразами [20].
В данной работе на примере одиночных человеческих тромбоцитов мы исследовали возможное влияние используемого флуоресцентного зонда и условий его проникновения в клетку на наблюдаемую кальциевую динамику. В результате работы мы делаем вывод о положительной корреляции между интенсивностью мобилизации кальция в тромбоците в ответ на активацию и уровнем флуоресценции флуорофора в нём.
Материалы и Методы
Материалы
Следующие материалы были получены из источников, указанных в скобках: человеческий тромбин (Hematologic Technologies, США), Calbryte 590 AM, Fura Red AM, Fluo 4 AM и DiOC6(3) (Molecular probes, США.), гирудиновые пробирки S-Monovette Hirudin 1.6 мл (SARSTEDT AG Co. KG, Германия), цитратные (3.8%) пробирки 4.5 мл (IMPROVACUTER, Китай). Картофельная апираза, АДФ и реагенты для растворов были получены от компании Sigma-Aldrich. Антитела VM64 были получены от профессора Мазурова. Материалы для изготовления проточных камер были произведены компаниями ГемаКор (Москва, Россия) и МедСил (Мытищи, Россия).
Методы
Для экспериментов использовалась цельная кровь здоровых добровольцев (11 человек, в возрасте 18-45 лет) в течение 3 часов после взятия. Кровь забирали в пробирки объемом 4.5 мл, содержащие 3,8% цитрата натрия (1:9 об/об), или в пробирки объемом 1,6 мл, содержащие R-гирудин. Исследования проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрены этическим комитетом ЦТП ФХФ РАН (решение №1 от 12.01.2018 г.), от всех доноров было получено письменное информированное согласие.
В данном исследовании были применены восемь различных протоколов (A–H) для загрузки кальций-чувствительных зондов в тромбоциты. Протоколы A–E основаны на применении крови, антикоагулированной цитратом натрия (3,8 % об./об.), в то время как в протоколах F–H в качестве антикоагулянта использовался гирудин (>525 антитромбиновых единиц/мл). В качестве флуоресцентного зонда в протоколах A, B, D, E и H применяли Calbryte590-AM (2 мкМ), в протоколе C — DiOC6(3), в протоколе F — Fluo4 AM (2 мкМ), а в протоколе G — Fura Red AM (2 мкМ). Для предотвращения преждевременной активации тромбоцитов под действием АДФ, секретируемого эритроцитами, во все протоколы добавляли апиразу (0,3 ед/мл). Протокол D дополнительно содержал Pluronic F-127 (0,04%), а во время протокола E через 15 минут после начала инкубации крови с кальциевым зондом добавляли 5 мМ MβCD (метил-β-циклодекстрин).
Полученную смесь инкубировали в течение 30 минут (протоколы A, B, D, E, F, G, H) или 5 минут (протокол C) при температуре 37°C (A, D, E, F, G, H) или 25°C (B, C). Таким образом, протокол A можно рассматривать в качестве контроля для красителя CalBryte590, протокол C — для DiOC6, протокол F — для Fluo4, а протокол G — для Fura Red. Протоколы A, B, D и E используют различные условия для загрузки зонда CalBryte590 в тромбоциты: протокол B характеризуется пониженной температурой инкубации, протокол D — присутствием Pluronic F-127 (реагент, облегчающий проникновение гидрофобного АМ-хвоста в клетку), а протокол E — добавлением MβCD (реагент для истощения запасов холестерина в мембране тромбоцитов).
В данной работе использовались плоско-параллельные проточные камеры, описанные ранее [21]. Иммобилизацию тромбоцитов проводилась на покровных стёклах, покрытых моноклональными антителами к CD31 [22]. После вмывания цельной крови через камеру и последующей адгезии тромбоцитов к покрытой антителами поверхности, несвязавшиеся клетки смывали буфером Тирода с кальцием. Затем активацию тромбоцитов контролировали в режиме постоянной перфузии буферами, содержащих активаторы. Визуализацию осуществляли с использованием инвертированного микроскопа Nikon Eclipse Ti-E, оснащённого объективом CFI Apochromat TIRF 100XC Oil (увеличение 100x, числовая апертура 1.49). Флуоресцентные зонды возбуждали лазерным излучением с длинами волн 405, 488 и 561 нм. Регистрацию флуоресценции проводили на камеру Andor iXon3 EMCCD. Схема эксперимента приведена на рисунке 1.
Для анализа экспериментальных данных использовалась программа ImageJ-Fiji. Внутри клеток были выбраны области интереса (ROI) диаметром 2 мкм. Для каждого временного шага измерялась усредненная интенсивность флуоресценции внутри этих ROI. На основе этих данных были построены профили интенсивности флуоресценции (рис. 2). Предварительная активация тромбоцитов оценивалась путем идентификации конкретных типов тромбоцитов в поле зрения (FOV), как было описано ранее [23]: (1) отсутствие ответа (менее пяти случайных одиночных пиков в минуту), (2) слабый ответ (множественные стохастические пики, которые обычно не образуют кластеров), (3) сильный ответ (пики сливаются в кластеры) и (4) стабильно сильный ответ (изменения интенсивности флуоресценции в основном вызваны обесцвечиванием или утечкой флуоресцентного зонда) (рис. 2).
Количество флуорофора, «загруженного» в тромбоцит, считалось равным средней флуоресценции 10% точек с наименьшей интенсивностью флуоресценции для данного профиля (Рис. 3).
Результаты и обсуждение
Тромбоциты загружаются гетерогенно различными флуоресцентными зондами
Для исследования феномена гетерогенности количества флуоресцентного зонда в популяции тромбоцитов одного и того же донора в первую очередь мы определили его зондовую специфичность. Исследовались тромбоциты, иммобилизованные на VM64 (анти-CD31). Количество зонда в тромбоците оценивалось по профилю в первые 15 секунд эксперимента. Тромбоциты одного и того же донора загружались четырьмя различными флуоресцентными зондами: CalBryte 590-AM (Протокол H), DiOC6(3) (Протокол C), Fura Red-AM (Протокол F) и Fluo-4-AM (Протокол G) (Рис. 4). Для всех зондов наблюдалась гетерогенность базовой интенсивности флуоресценции тромбоцитов со отклонением интенсивности флуоресценции от медианного значения составляющим 2-6 раз для 30% популяции. Достаточно неожиданным результатом оказалось что зонды Calbryte 590-AM (Рис. 4А) и Fluo-4-AM (Рис. 4C) загружаются более гомогенно, чем DiOC6 (Рис. 4B) и Fura Red-AM (Рис. 4D).
Наблюдаемые различия в загрузке тромбоцитов зондами могут быть связаны с размером и полярностью молекул флуоресцентного зонда. Наличие у тромбоцитов разности потенциалов на плазматической мембране [24,25] облегчает вход катионным зондам и затрудняет анионным. Однако, гетерогенность потенциала в популяции может приводить к гетерогенности загрузки. Так как DiOC6(3) является потенциал-чувствительным зондом, не содержащим части –AM, его распределение в популяции тромбоцитов отражает именно это свойство тромбоцита (Рис. 4B). Для Fluo-4 известна гетерогенность распределения краски внутри тромбоцита [26], связанная в первую очередь с компартментализацией краски. Причины такой гетерогенности до конца не изучены. Возможно, именно компартментализация зонда является причиной наблюдаемой гетерогенности его распределения в популяции. Однако, известно, что снижение температуры инкубации и использование поверхностно-активных веществ снижает компартментализацию зондов [27].
Для выяснения причины неравномерной загрузки тромбоцитов флуоресцентными зондами мы использовали краситель CellTracker Violet BMQC (Рис. 5). Нашей целью являлась визуализация положения клетки в пространстве. Данный краситель является производным кумарина, он может свободно проникать в клетку и оставаться внутри нее в течение длительного времени благодаря связыванию с глутатионом. У нас нет данных о том, что интенсивность флуоресценции этого красителя зависит от концентрации кальция в цитозоле, следовательно, состояние плазматической мембраны играет решающую роль в проникновении красителя в клетку.
Загрузка тромбоцитов флуоресцентным зондом зависит от окружающих условий
Для проверки гипотезы о потенциальном влиянии условий инкубации на гетерогенность распределения зонда в популяции тромбоцитов, мы сравнили количество зонда, попадающего в клетку при различных условиях загрузки: при комнатной температуре (протокол В, см. Методы), в присутствии гидрофобного агента (протокол D) или при деплетировании холестерола из мембраны (протокол E) (рис. 6). Статистическая значимость различий количества «загруженного» зонда рассчитывалась с помощью критериев Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова (Таблица 1).
Все три выборки не принадлежат одному закону распределения с контрольной. Выборки MβCD и 25°C для обоих критериев дают p-value меньше 0.01, выборка с Pluronic F-127 для критерия Колмогорова-Смирнова дает p-value меньше 0.01, а для критерия Манна-Уитни дает p-value меньше 0.05.
В результате исследования можно утверждать, что инкубация при комнатной температуре по сравнению с инкубацией при 37°C понижает среднюю и медианную интенсивности флуоресценции клеток более чем на 100%. Этот результат соответствует известным данным об увеличении проницаемости мембраны клетки с температурой [28].
Инкубация в присутствии Pluronic F-127 снижает количество зонда в тромбоците в среднем на 240%, при этом на 23% повышая медианное значение. Верхняя граница 95% доверительного интервала уменьшилась более чем на 550%. Плюроник является поверхностно-активным веществом (ПАВ) и повышает растворимость зондов в АМ форме [29], что соответствует наблюдаемому более равномерному распределению зонда в клетке и снижению количества сверхзагруженных тромбоцитов (о чем свидетельствует падение среднего значения, но сохранения медианного по сравнению с контролем). Инкубация с МβCD повышает среднее (на 17.7%) и медианное (на 72.9%) значения интенсивности флуоресценции по сравнению с контрольной выборкой.
MβCD увеличивает текучесть мембраны тромбоцита за счет снижения концентрации холестерола [30], при этом не приводя к активации клеток [31,32]. Наблюдаемые значения количества зонда показывают, что в этом случае при прочих равных условиях в клетку проходит больше зонда, что позволяет предположить зависимость количества зонда от состояния мембраны.
MβCD повышает скорость загрузки клеток флуоресцентным зондом
Для дополнительного исследования влияния содержания холестерола в мембране на загрузку тромбоцитов зондом было проведено наблюдение скорости загрузки тромбоцитов флуоресцентным зондом Calbryte 590-AM в контрольных условиях (протокол А) и в условиях инкубации с MβCD (протокол E) (Рис. 7). Как видно из рисунка 7, MβCD повышает скорость входа зонда в клетку приблизительно в 2 раза, соответственно, различимое в нашей экспериментальной постановке возрастание интенсивности флуоресценции в цитозоле клеток начинается в 2 раза быстрее, чем в обычных условиях.
Количество зонда в тромбоците коррелирует с его способностью к активации
Таким образом, проведенные эксперименты показывают, что, независимо от типа зонда и условий загрузки, флуоресцентный зонд неравномерно входит в тромбоциты в популяции. Возникает вопрос, насколько этот феномен важен для исследования кальциевой сигнализации в тромбоцитах? Для ответа на этот вопрос мы проверили, как связаны базовая интенсивность флуоресценции зонда в клетке и её активация (Рис. 8). Количество зонда в тромбоците оценивалось по профилю в первые 15 секунд эксперимента, а разделение тромбоцитов на группы по активации проходило по профилям, снятым в течение 5 минут. На рисунке 7 показана полученная зависимость группы активации от количества зонда («нижней границе» интенсивности флуоресценции CalBryte590 в клетке). Оказалось, что тромбоциты из четвертой группы активации обладали в среднем в 10 раз большим количеством зонда, чем тромбоциты из третьей группы. Этот результат легко объяснить возможной активацией тромбоцитов четвертой группы на момент начала наблюдения. Однако, тромбоциты из третьей группы активации также обладали в 7 раз большим количеством зонда, чем тромбоциты из второй группы, которые, в свою очередь, обладали в 1.5 раза большим количесвом зонда чем тромбоциты первой группы. Так как тромбоциты групп 1-3 имеют ярко выраженный базовый уровень (Рис. 2), то мы делаем вывод что степень активации тромбоцита коррелирует с количеством флуорофора.
Для более детального исследования наблюдаемого явления, мы решили оценить вероятность попадания тромбоцита с заданным значением базовой флуоресценции в каждую из групп активации с помощью имеющейся выборки (Рис. 9). Вероятность испытать «сильную» активацию для тромбоцита с высокой базовой интенсивностью флуоресценции выше, чем для тромбоцита с низкой базовой интенсивностью флуоресценции.
Таким образом можно утверждать, что при наблюдении активации тромбоцитов по изменению концентрации кальция в суспензии (методами проточной цитометрии или спектрофлуориметрии) наблюдаются в первую очередь тромбоциты, сильнее реагирующие на активацию, таким образом общий ответ популяции сдвинут представляется более сильным, чем это происходит в физиологических условиях.
Заключение
Мы показали, что присутствует гетерогенность базовой интенсивности флуоресценции тромбоцитов при загрузке флуоресцентным зондом CalBryte 590 AM. Эта гетерогенность проявляет неслучайный характер. Было выяснено, что вероятность испытать «сильную» активацию для тромбоцита с высокой базовой интенсивностью флуоресценции выше, чем для тромбоцита с низкой базовой интенсивностью флуоресценции. На гетерогенность загрузки тромбоцитов зондом, как и на сам процесс загрузки, можно повлиять различными агентами и изменением условий эксперимента. Мы пронаблюдали это на примере флуоресцентного зонда CalBryte 590 AM. Понижение температуры инкубации с 37°C до 25°C ведет к замедлению загрузки клеток зондом. Pluronic F-127 заставляет зонд распределяться по клеткам равномернее, но при этом не оказывает воздействие на саму мембрану тромбоцита. MβCD не только повышает интенсивность флуоресценции зонда в цитозоле по сравнению с контрольными условиями, но и увеличивает скорость загрузки тромбоцитов зондом.
Гетерогенность загрузки клеток характерна не только для зонда CalBryte 590 AM.Мы показали, что флуоресцентные зонды DiOC6(3), Fura Red AM, Fluo-4 AM также загружаются в тромбоциты гетерогенно.
Сопоставимая с остальными зондами гетерогенность загрузки DiOC6(3) говорит о том, что присутствует заметная неоднородность разности потенциалов на мембранах тромбоцитов. Предполагается, что это частично объясняет феномен гетерогенности загрузки клеток в целом.
Однако, для того чтобы дать определенный ответ о причине гетерогенности загрузки тромбоцитов приведенными выше флуоресцентными зондами, полученных нами данных недостаточно. Требуется исследование, включающее в себя комбинации эффектов использованных нами параметров и учёт неиспользованных, таких как размер молекулы зонда, ее квантово-химические свойства. Но уже сейчас можно выделить ряд факторов, существенно влияющих на количество флуоресцентного зонда в живой клетке. Во-первых, важен состав плазматической мембраны: гидрофобные низкомолекулярные вещества тем лучше проходят через мембраны, чем больше в ней ненасыщенных жирных кислот. Понижение температуры загрузки приводит к снижению количества зонда в цитозоле. Во-вторых, влияют физико-химическое состояние зонда вне клетки и активность неспецифических эстераз, отрезающих АМ-”хвосты”. Также присутствуют еще два фактора, чувствительных к активации клетки: наличие неспецифических каналов или переносчиков как для АМ-формы зонда, так и для рабочей формы, и чувствительность одной из форм зонда к разности потенциалов на мембране в результате наличия у нее заряда.
Финансирование
Данное исследование было профинансировано РФБР и Королевским обществом Лондона (RS), номер проекта 21-51-10005.
Список литературы
1. Panteleev MA, Dashkevich NM, Ataullakhanov FI. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis research. 2015;136(4):699–711.
2. Panteleev MA, Sveshnikova AN. Platelets and hemostasis. Oncohematology. 2014;9(2):65–73.
3. Kaneva VN, Martyanov AA, Morozova DS, Panteleev MA, Sveshnikova AN. Platelet Integrin αIIbβ3: Mechanisms of Activation and Clustering; Involvement into the Formation of the Thrombus Heterogeneous Structure. Biochem Moscow Suppl Ser A. 2019 Apr 1;13(2):97–110.
4. Sveshnikova A, Stepanyan M, Panteleev M, Sveshnikova A, Stepanyan M, Panteleev M. Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 1: responses. Systems Biology and Physiology Reports. 2021 Mar;1(1):20.
5. Topalov NN, Kotova YN, Vasil’ev SA, Panteleev MA. Identification of signal transduction pathways involved in the formation of platelet subpopulations upon activation. BrJHaematol. 2012;157(1365-2141 (Electronic)):105–15.
6. Podoplelova NA, Sveshnikova AN, Kotova YN, Eckly A, Receveur N, Nechipurenko DYu, et al. Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting. Blood. 2016;128(13):1745–55.
7. Nechipurenko DY, Receveur N, Yakimenko AO, Shepelyuk TO, Yakusheva AA, Kerimov RR, et al. Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019;39(1):37–47.
8. Heemskerk JWM, Feijge MAH, Henneman L, Rosing J, Hemker HC. The Ca2 + -mobilizing potency of a-thrombin and thrombin-receptor-activating peptide on human platelets Concentration and time effects of thrombin-induced Ca2 + signaling. European Journal of Biochemistry. 1997;555:547–55.
9. Martyanov AA, Morozova DS, Sorokina MA, Filkova AA, Fedorova DV, Uzueva SS, et al. Heterogeneity of Integrin αIIbβ3 Function in Pediatric Immune Thrombocytopenia Revealed by Continuous Flow Cytometry Analysis. IJMS. 2020 Apr 25;21(9):3035.
10. Sage SO, PUGH N, MASON MJ, HARPER AGS. Monitoring the intracellular store Ca2+ concentration in agonist-stimulated, intact human platelets by using Fluo-5N. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011;9(3):540–51.
11. Martyanov A, Panteleev M. Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 2: receptors. SBPR. 2021 Sep;1(3):13–30.
12. Carafoli E, Krebs J. Why Calcium? How Calcium Became the Best Communicator. J Biol Chem. 2016 Sep 30;291(40):20849–57.
13. Carafoli E. The calcium-signalling saga: tap water and protein crystals. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Apr;4(4):326–32.
14. Harper MT, Londoño JEC, Quick K, Londoño JC, Flockerzi V, Philipp SE, et al. Transient receptor potential channels function as a coincidence signal detector mediating phosphatidylserine exposure. SCIENCE SIGNALING. 2013;6(281):1–11.
15. Sveshnikova AN, Balatskiy AV, Demianova AS, Shepelyuk TO, Shakhidzhanov SS, Balatskaya MN, et al. Systems biology insights into the meaning of the platelet’s dual-receptor thrombin signaling. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016;14(10):2045–57.
16. Heemskerk JWM, Vis P, Feijge MAH, Hoylandll J, Mason WT. Roles of Phospholipase C and Ca2 ’ -ATPase in Calcium Responses of Single , Fibrinogen-bound Platelets *. The Journal of biological chemistry. 1993;268(1):356–63.
17. Heemskerk JWM, Hoyland J, Masont WT, Sage S. Spiking in cytosolic calcium concentration in single fibrinogen-bound fura-2-loaded human platelets. BiochemJ. 1992;283 ( Pt 2(0264-6021 (Print)):379–83.
18. Obydennyy SI, Sveshnikova AN, Ataullakhanov FI, Panteleev MA. Dynamics of calcium spiking, mitochondrial collapse and phosphatidylserine exposure in platelet subpopulations during activation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016;14(9):1867–81.
19. Ha T, Tinnefeld P. Photophysics of Fluorescent Probes for Single-Molecule Biophysics and Super-Resolution Imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 2012;63(1):595–617.
20. Takahashi A, Camacho P, Lechleiter JD, Herman B. Measurement of Intracellular Calcium. Physiological Reviews. 1999 Jan 10;79(4):1089–125.
21. Balabin FA, Morozova DS, Mayorov AS, Martyanov AA, Panteleev MA, Sveshnikova AN. Clusterization of Inositol Trisphosphate Receptors Determines the Shape of the Calcium Oscillation Peak in Platelet Cytosol. Moscow Univ Phys. 2018 Sep;73(5):526–33.
22. Mazurov AV, Vinogradov DV, Kabaeva NV, Antonova GN, Romanov YA, VIasik TN, et al. A Monoclonal Antibody, VM64, Reacts with a 130 kDa Glycoprotein Common to Platelets and Endothelial Cells: Heterogeneity in Antibody Binding to Human Aortic Endothelial Cells. Thromb Haemost. 1991;66(10):494–9.
23. Balabin FA. Quantitative Assessment of Heterogeneity of Single Platelet Calcium Responses to Activation. Res Pract Thromb Haemost. 2021;5 (Suppl 2):PB1027.
24. Kokhan A, Zdanevich S, Prokofev I, Gorudko I, Shamova E. Patch-clamp technique for studying ion channels in activated platelets. Systems Biology and Physiology Reports. 2021 Mar;1(1):3.
25. Mahaut-Smith MP. Calcium-activated potassium channels in human platelets. The Journal of Physiology. 1995 Apr 1;484(1):15–24.
26. Thomas D, Tovey SC, Collins TJ, Bootman MD, Berridge MJ, Lipp P. A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals. Cell Calcium. 2000 Oct;28(4):213–23.
27. Thompson K, Dockery P, Horobin R. Predicting and avoiding subcellular compartmentalization artifacts arising from acetoxymethyl ester calcium imaging probes. The case of fluo-3 AM and a general account of the phenomenon including a problem avoidance chart. Biotechnic & Histochemistry. 2012 Oct;87(7):468–83.
28. Rink TJ, Pozzan T. Using quin2 in cell suspensions. Cell Calcium. 1985 Apr 1;6(1):133–44.
29. Nejadnik MR, Olsson ALJ, Sharma PK, van der Mei HC, Norde W, Busscher HJ. Adsorption of pluronic F-127 on surfaces with different hydrophobicities probed by quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 2009 Jun 2;25(11):6245–9.
30. Meyer F de, Smit B. Effect of cholesterol on the structure of a phospholipid bilayer. PNAS. 2009 Mar 10;106(10):3654–8.
31. Moscardó A, Vallés J, Latorre A, Santos MT. The association of thromboxane A2 receptor with lipid rafts is a determinant for platelet functional responses. FEBS Lett. 2014 Aug 25;588(17):3154–9.
32. Grgurevich S, Krishnan R, White MM, Jennings LK. Role of in vitro cholesterol depletion in mediating human platelet aggregation. J Thromb Haemost. 2003 Mar;1(3):576–86.